Programmbereich Infektionen

Mikrobielle Grenzflächenbiologie

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Projekte

I.

Der WNT-Signalweg in der M. tuberculosis Infektion -
Von neuen Mediatoren zur wirtsgerichteten Therapie

Aufbauend auf früheren Arbeiten zur funktionellen Bedeutung von Mustererkennungsrezeptoren bei der M. tuberculosis-Infektion konnten wir durch systematische Analysen von mykobakterieninfizierten Makrophagen als erste eine regulatorische Funktion für Komponenten des evolutionär hoch konservierten Wingless/Integrase 1 (WNT)-Signalwegs bei der Lungentuberkulose nachweisen. Mehrere Faktoren wie WNT5a, WNT3a und, wie kürzlich gezeigt wurde, WNT6 sind wichtig für die Interaktion des angeborenen Immunsystems mit dem adaptiven Immunsystem bei der Pathogenese der Tuberkulose, aber auch bei anderen entzündlichen und infektiösen Erkrankungen. WNT-Proteine haben entzündungsfördernde oder entzündungshemmende Wirkungen auf Makrophagen und andere Zellen des Immunsystems und zeigen mitunter auch einen Einfluss auf die Entwicklung der Bakterienzahl während der Infektion.

Die WNT6/ACC2-induzierte Speicherung von Triacylglycerolen in Makrophagen wird von Mycobacterium tuberculosis ausgenutzt

Vor einigen Jahren konnten wir eine starke Expression von WNT6 in granulomatösen Läsionen in der Lunge von M. tuberculosis-infizierten Mäusen nachweisen. Eine detaillierte Analyse ergab eine unerwartete neue Rolle für WNT6 in der Makrophagenfunktion, da WNT6 die Differenzierung und Proliferation von Makrophagen beeinflusst. Unsere Beobachtung, dass die Mehrzahl der WNT6-exprimierenden Makrophagen Lipidkörper enthält, ließ uns vermuten, dass M. tuberculosis durch WNT6 die Bildung von Schaum-Makrophagen fördert. Diese Schaumzellen, die mit Lipidkörpern gefüllt sind, stellen ein wichtiges Habitat für M. tuberculosis während der Tuberkuloseinfektion dar. Angesichts der aufkommenden arzneimittelresistenten Tuberkulose (TB) sind wirts-gerichtete Zusatztherapien dringend erforderlich, um die Behandlungsergebnisse mit den derzeit verfügbaren Anti-TB-Therapien zu verbessern. Eine Möglichkeit besteht darin, die oben erwähnte Bildung von lipidbeladenen "schaumigen" Makrophagen im Wirt zu unterbinden, da diese eine nährstoffreiche Wirtszellumgebung für Mycobacterium tuberculosis darstellen. Wir konnten nun nachweisen, dass WNT6 in der Tat die Bildung von Schaumzellen während der pulmonalen TB fördert, indem es wichtige Gene des Lipidstoffwechsels reguliert, darunter die Acetyl-CoA-Carboxylase 2 (ACC2). Mithilfe genetischer und pharmakologischer Ansätze konnten wir nachweisen, dass das Fehlen von funktionellem WNT6 oder ACC2 den intrazellulären Triacylglycerol (TAG)-Spiegel und das Überleben von M. tuberculosis in Makrophagen deutlich reduziert. Darüber hinaus verminderte die Behandlung von mit M. tuberculosis-infizierten Mäusen mit einer Kombination aus einem pharmakologischen ACC2-Inhibitor und dem Anti-TB-Medikament Isoniazid (INH) die TAG- und Zytokinwerte in der Lunge sowie das Lungengewicht im Vergleich zur Behandlung mit INH allein. Diese Kombination reduzierte auch die Anzahl der Mtb-Bakterien und die Größe der mononuklearen Zellinfiltrate in den Lebern infizierter Mäuse. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass M. tuberculosis die WNT6/ACC2-induzierte Speicherung von TAGs in Makrophagen ausnutzt, um sein intrazelluläres Überleben zu erleichtern, eine Erkenntnis, die neue Perspektiven für eine auf den Wirt ausgerichtete Zusatzbehandlung der pulmonalen TB eröffnet.

 

Abbildung 1: (A) Keimzahlbestimmung (CFU) von human makrophagen-ähnlichen mit M. tuberculosis-infizierten Blaer Zellen (MOI 0.5:1, Wildtyp (WT), ACC1-KO, und ACC2-KO) an Tag 0 (4 h) und Tag 3 nach Infektion (d3); n = 3. (B–D) Keimzahlbestimmung (CFU) von human Makrophagen 7 Tage nach Infektion mit M. tuberculosis (MOI 1:1) in An-und Abwesenheit von pharmakologischen ACC2 Inhibitoren. n = 3. (Brandenburg J, et al., J Clin Invest (2022))

 

 

 

II.

„TB is not TB“ – The impact of pathogen variability

Es hat sich gezeigt, dass klinische Isolate des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes (MTBC) sich genetisch wesentlich stärker unterscheiden als lange angenommen. In einer früheren Studie, in der wir Infektionsversuche mit humanen Primärmakrophagen und aerosolinfizierten Mäusen durchführten, haben wir spezifische Virulenzmuster klinischer MTBC-Isolate identifiziert. Ausschließlich an den Menschen angepasste M. tuberculosis-Linien, auch als Klade I oder "moderne" Linien bezeichnet, wie z. B. Beijing oder Haarlem Isolate, zeigen im Vergleich zu "ancestralen" Stämmen der Klade II, zu denen ostafrikanisch-indische M. tuberculosis (EAI) und M. africanum-Isolate gehören, eine deutlich höhere Fähigkeit, in humanen Makrophagen zu wachsen. Eine einfache Korrelation zwischen der Virulenz des verwendeten MTBC-Stammes und dem Entzündungspotenzial eines solchen Isolats wurde jedoch nicht beobachtet. Unsere Daten lassen unterschiedliche Pathogenitätsprofile erkennen, die im Detail untersucht werden sollem. Unsere Arbeit zeigt auch, dass in weiteren Studien zum Verständnis der Wirt-Pathogen-Interaktionen in der Tuberkulose neben wirtsspezifischen Faktoren auch erregerspezifische Merkmale berücksichtigt werden müssen.

Substamm-spezifische Phenol-Glykolipid-Muster im Mycobacterium tuberculosis-Komplex des Stammes 1

Die "ancestralen" Stämme des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes (MTBC) der Linie 1 (L1, ostafrikanisch-indisch (EAI)) sind in den Ländern rund um den Indischen Ozean eine wichtige Ursache für Tuberkulose (TB). Die Pathobiologie der L1-Stämme ist jedoch nur unzureichend charakterisiert. Hier haben wir 312 L1-Stämme aus 43 Ländern mittels Genomsequenzierung (WGS) untersucht, um die globale L1-Populationsstruktur zu charakterisieren und diese mit der Analyse der Synthese phenolischer Glykolipide (PGL) zu korrelieren. Hierbei handelt es sich um bekannte MTBC-Virulenzfaktoren, die von Polyketiden stammen. Unsere Ergebnisse zeigen das Vorhandensein von acht großen L1-Unterlinien, deren Mitglieder spezifische Sequenzsignaturen in PGL-Biosynthesegenen aufweisen, z. B. in pks15/1 oder den Glykosyltransferasen Rv2962c und/oder Rv2958c. Die Sublinien-spezifische PGL-Produktion wurde durch NMR-basiertes Lipid-Profiling untersucht, und Stämme mit vollständig ausgeschalteter Phenolphthiocerol-Dimycoserosat-Biosynthese zeigten im Durchschnitt ein stärkeres Wachstum in menschlichen Makrophagen. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse eine vielfältige Populationsstruktur von L1-Stämmen, die mit dem Vorhandensein spezifischer PGL-Typen verbunden ist. Dazu gehört auch das Vorkommen von Mycosid B in einer Unterlinie, was die erste Beschreibung eines PGL in einer anderen M. tuberculosis-Linie als L2 darstellt. Solche Unterschiede könnten für die Evolution von L1-Stämmen wichtig sein, z. B. um die Anpassung an verschiedene menschliche Populationen zu ermöglichen.

Abbildung 2: L1-MTBC-Stämme, bei denen die Phenolphthiocerol-Dimycoserosat-Biosynthese aufgrund einer 1 bp-Insertion in Rv2946c vollständig aufgehoben ist zeigen ein verstärktes Wachstum in humanen Makrophagen (ja: PGL-Gruppe 2; nein: alle anderen PGL-Gruppen). Dargestellt ist die Keimzahlentwicklung (CFU) (Mittelwerte ± SEM der analysierten Stämme (**P = 0.0083, Mann-Whitney U test).an Tag7 im Vergleich zu Tag 0 (4 Stunden) (Gisch N, et al., Front Microbiol. (2022))

 

 

Tuberkulostearinsäure-haltige Phosphatidylinositole als Marker für die bakterielle Belastung bei Tuberkulose

Schätzungsweise ein Viertel der Weltbevölkerung ist mit Stämmen des Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC), dem Erreger der Tuberkulose (TB), infiziert. Mithilfe lipidomischer Ansätze zeigen wir, dass Tuberkulostearinsäure (TSA)-haltige Phosphatidylinositole (PIs) molekulare Marker für die Infektion mit klinisch relevanten MTBC-Stämmen sind und die bakterielle Belastung anzeigen. Für den am häufigsten vorkommenden Lipidmarker wurden Nachweisgrenzen von ∼10e2 koloniebildenden Einheiten (KBE) bzw. ∼10e3 KBE für bakterielle und Zellkultursysteme ermittelt. Wir haben ein Analyseverfahren entwickelt, das einschließlich der Probenvorbereitung innerhalb eines Tages durchgeführt werden kann - etwa 30-mal schneller als herkömmliche Methoden, die auf Bakterienkulturen basieren. Mit diesem indirekten und kulturfreien Nachweisverfahren konnten wir die Erregerlast in infizierten murinen Makrophagen, humanen Neutrophilen und murinem Lungengewebe bestimmen. Diese aus den mykobakteriellen PIs abgeleiteten Markerlipide wurden in den mononukleären Zellen des peripheren Blutes von TB-Patienten in höheren Konzentrationen gefunden als bei gesunden Personen. Darüber hinaus wurden in einer kleinen Kohorte antibiotika-empfänglicher TB-Patienten zu Beginn der Therapie erhöhte Konzentrationen dieser molekularen Marker festgestellt, die nach erfolgreicher Anti-TB-Behandlung zurückgingen. Somit kann die Konzentration von TSA-haltigen PIs als Korrelat für die mykobakterielle Belastung in experimentellen Modellen und In-vitro-Systemen verwendet werden und könnte in Zukunft auch ein klinisch relevantes Instrument zur Überwachung des Schweregrads der TB darstellen.

 

Abbildung 3: (oben) Struktur des sn-1-Isomers von PI 16:0_19:0 (TSA), das als Marker für Mykobakterienlasten und KBE verwendet werden kann. (links) Nachweis von Mtb in Kulturen mit PI 16:0_19:0 und metabolischer Markierung von TSA. Korrelation zwischen der Menge an PI 16:0_19:0 (TSA) und KBE (n = 3) von Mtb H37Rv (mCherry). (Brandenburg J, et al., ACS Infect Dis. (2022))

 

 

 

 

 

III.       

"Ein Magnet hilft" - Die Verwendung eines ungewöhnlichen Lipopeptids und magnetischer Beads in der Infektionsforschung zu M. tuberculosis 

Pathogene Mykobakterien sind nach der Aufnahme durch Makrophagen in der Lage, die normale Reifung des sie enthaltenden Phagosoms zu verzögern und zu blockieren. Eine Fusion mit lysosomalen Kompartimenten findet nicht statt und der Erreger überlebt in der Zelle.  Um nun die strukturellen Merkmale von Phagosomen, die pathogene Mykobakterien enthalten, analysieren zu können, haben wir eine immunmagnetische Methode - unter Verwendung des biotinylierten Lipopeptids Lipobiotin  - entwickelt, um diese Phagosomen aus Primärzellen zu isolieren und funktionell zu charakterisieren. Der geringe Zeitbedarf und die Vielseitigkeit der in der FG entwickelten Methode ermöglichen eine vergleichende biochemische und massenspektrometrische Analyse von Mykobakterien-haltigen Phagosomen. Unser Ziel ist es, wesentliche Faktoren und Mechanismen zu identifizieren, die für das Überleben von pathogenen Mykobakterien bzw. die erfolgreiche Abtötung des Erregers durch die Wirtszelle wichtig sind. Auf der Grundlage dieses Ansatzes haben wir uns dann gefragt, ob dasselbe Lipid, das bei der Phagosomenisolierung verwendet wird, auch bei der Anreicherung von Mykobakterien aus Puffern und komplexeren Flüssigkeiten wie zB Speichel hilfreich sein könnte.

Der Lipobiotin-Capture-Magnetbead-Assay zur Isolierung, Anreicherung und zum Nachweis von Mycobacterium tuberculosis aus Speichel

Die Lungentuberkulose (TB) wird in der Regel durch die Analyse von Sputumproben diagnostiziert. Da die Entnahme von Sputumproben bei Kindern und kachektischen Patienten eine Herausforderung darstellt, erscheint die Entwicklung von diagnostischen Tests mit Speichel zunächst vielversprechend. Dieser Ansatz wurde aber aufgrund der geringen Bakterienlast und der geringen Empfindlichkeit nicht weiterverfolgt. Hier stellen wir eine neuartige und schnelle Methode zur Anreicherung von Mycobacterium tuberculosis (Mtb) aus Speichel vor, die als Grundlage für einen diagnostischen Speicheltest dienen könnte. Lipobiotin-funktionalisierte Magnetbeads (LMBs) wurden mit Mtb-dotiertem PBS und Speichel von gesunden Spendern sowie mit Speichel von TB-Patienten inkubiert. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie wurde die Bindung von Mtb an die Magnetbeads analysiert, während die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) zum Nachweis von Mtb und zur Bestimmung der Menge an mykobakterieller DNA in verschiedenen Probentypen eingesetzt wurde. Wir fanden heraus, dass LMBs Mtb im Vergleich zu nicht funktionalisierten Beads effizient binden. Die Entwicklung eines qPCR-Assays auf der Grundlage von LMBs (LMB-Assay) ermöglichte uns die Anreicherung von mykobakterieller DNA in dotierten Probentypen, einschließlich PBS und Speichel von gesunden Spendern (Anreicherung um das ~8,7-fache). Bei mit Mtb versetzten Speichelproben konnten wir feststellen, dass der LMB-Assay die Nachweisrate von 10e2 Bakterien in einem Volumen von 5 ml von 0 von 15 (0 %) auf 6 von 15 (40 %) verbesserte. In Übereinstimmung damit erhöhte der LMB-Test die Rate der korrekt identifizierten Speichelproben von TB-Patienten in zwei unabhängigen Kohorten. Die Umsetzung des Prinzips des LMB-basierten Assays könnte die Empfindlichkeit bestehender Diagnosetechniken verbessern, z. B. durch die Funktionalisierung von Materialien, die die Mtb-Probenahme aus der Mundhöhle erleichtern.

Abbildung 4. Auswirkung des LMB-Assays auf den qPCR-basierten Nachweis von Mtb im Speichel. Speichelproben von gesunden Probanden wurden mit Mtb H37Rv versetzt und entweder unbehandelt gelassen oder mit LMBs vorbehandelt (LMB-Assay). Das gleiche Volumen der unbehandelten oder mit LMB vorbehandelten Probe wurde einer Wärmebehandlung, DNA-Reinigung und qPCR-Analyse unterzogen. Die Linie bei jeder Bedingung zeigt den Median der Daten von fünf unabhängigen Experimenten, die jeweils aus drei technischen Wiederholungen bestehen. Über jeder Bedingung ist der Prozentsatz (%) der Proben angegeben, in denen kein Signal nachgewiesen werden konnte (nicht nachweisbar, n.d.). Ctrl, Kontrolle, keine Bakterien hinzugefügt. Als statistischer Test wurde eine nichtparametrische Varianzanalyse für wiederholte Messungen verwendet, die die Daten aller Bakteriendosen einschliesst (unbehandelt vs. LMB-Assay; p = 6,038205 x 10-35).(Hansen J et al., PLOS ONE (2022)).

 

 

 

IV.

"New drugs wanted" - Schnelle und relevante Testsysteme zur Identifizierung neuer Verbindungen gegen M. tuberculosis

Da die Tuberkulose nach wie vor die weltweit häufigste durch einen einzelnen bakteriellen Erreger verursachte Erkrankung darstellt, besteht ein dringender Bedarf an neuen Antibiotika, um die Behandlung von Tuberkulosepatienten zu verbessern, insbesondere von solchen, die mit Antibiotika resistenten und multiresistenten Stämmen infiziert sind. Unsere Erfahrung im Umgang mit primären Makrophagen hat uns dazu veranlasst, unsere In-vitro-Infektionsmodelle mit M. tuberculosis auch zur Identifizierung und Charakterisierung der Wirksamkeit neuer Anti-TB-Leitstrukturen zu nutzen. Zu testende Verbindungen werden zunächst in einem Fluoreszenz-basierten Verfahren auf ihre Aktivität gegen mCherry10-exprimierende M. tuberculosis-Bakterien in einem 96-Well-Medium-Throughput-System getestet. Für die ersten Tests wird nur eine einstellige mg-Menge einer Verbindung benötigt. Dieses System, das 2013 eingeführt und kontinuierlich verbessert wurde, ermöglicht es uns, kleine und mittelgroße Substanzbibliotheken im Hinblick auf neue Anti-Tb-Verbindungen zu analysieren. Nach Studien zur zytotoxischen Wirkung der Verbindungen auf Wirtszellen (primäre Makrophagen) wird die Wirkung der neuen Verbindungen auf intrazelluläre Bakterien untersucht, wobei insbesondere M. tuberculosis-infizierte humane Makrophagen analysiert werden, um so vielversprechende Anti-TB-Leitstrukturen zu identifizieren. Wir sind sowohl an gezielten als auch an phänotypischen Screens mit verschiedenen Kooperationspartnern beteiligt. Wir sind stolz darauf Teil der Thematic Translational Transfer Unit Tuberculosis (TTU-TB) des Deutschen Zentrums für Infektionsforschung (DZIF) zu sein, die sich mit dem Thema "Neue Medikamente und Therapien" befasst. Darüber hinaus sind wir Partner in der von der EU geförderten Marie Skłodowska-Curie-Aktion "MepAnti" (die ein Ausbildungsnetzwerk für die Entwicklung neuer Antiinfektiva darstellt) sowie in mehreren vom BMBF geförderten Forschungskonsortien. Kürzlich haben wir ein High-Content-Imaging-System eingerichtet, mit dem wir auch Wirkstoffe identifizieren können, die nicht auf die Bakterien, sondern auf den Wirt abzielen, um Wirkstoffe für künftige, auf den Wirt gerichtete Therapieansätze zu identifizieren.

Abbildung 5: Schnelle und relevante Testsysteme zur Identifizierung neuer Verbindungen gegen M. tuberculosis