Infektionsimmunologie

Schützende Granulome können eine Infektion mit Mycobacterium tuberculosis langfristig unterdrücken. Sie sind funktionell organisiert und enthalten langlebige Immunzellen, die eine bakterielle Kontrolle ermöglichen. Diese Form protektiver Immunorganisation wird unter anderem durch entzündungsfördernde T-Helferzellen (Th) der Typen Th1 und Th17 unterstützt, welche spezifische Signale zur Aktivierung infizierter Makrophagen geben und antibakterielle Mechanismen in der Lunge verstärken. Gleichzeitig wird ihre Aktivität durch hemmende Zytokine reguliert, um Gewebeschäden zu begrenzen. Insbesondere das proinflammatorische Zytokin Interleukin (IL)-17, welches hauptsächlich durch Th17-Zellen und Gamma-Delta-T-Zellen produziert wird, spielt während der Granulomentwicklung eine wichtige Rolle. Um ein detaillierteres Verständnis der Zytokin-vermittelten Steuerungsmechanismen zur Etablierung und Aufrechterhaltung schützender Granulome zu gewinnen, interessiert sich die Forschungsgruppe Infektionsimmunologie für die differenzielle Bedeutung von Zytokinen und Zytokinrezeptoren, die mit der ubiquitären Rezeptoruntereinheit gp130 assoziiert sind. In diesem Zusammenhang konnten wir zeigen, dass das gp130-abhängige Zytokin IL-6 eine untergeordnete Rolle für die Entwicklung IL-17A-exprimierender Th17-Zellen während einer experimentellen Tuberkulose (TB) spielt, im Gegensatz zu seiner Schlüsselrolle bei der Induktion von Th17-Immunantworten im Rahmen anderer Entzündungskrankheiten. Das Fehlen von IL-6 oder gp130 auf T-Zellen hat dabei einen geringen Einfluss auf die Eindämmung der Infektion. Demgegenüber führt eine globale Defizienz für die Zytokinrezeptor-Untereinheit IL-27Rα in M. tuberculosis-infizierten Mäusen zu einer geringeren bakteriellen Last, gleichzeitig aber auch zu einer erhöhten Immunpathologie. IL-27Rα formt zusammen mit gp130 den Rezeptor des heterodimeren Zytokins IL-27. Die verstärkte Eindämmung der Mykobakterien wird in IL-27Rα-defizienten Mäusen von der Bildung hochstrukturierter schützender Granulome begleitet, welche sich aus einem Kern infizierter Makrophagen, umgeben von einem Saum protektiver T- und B-Zellen zusammensetzen. Durch die Analyse des Verlaufs einer M. tuberculosis-Infektion in IL-27Rα x IL-17A-doppelt-defizienten Mäusen konnten wir weiterführend zeigen, dass sich die schützende Wirkung einer IL-27Rα-Defizienz abhängig von der korrelierend auftretenden erhöhten Expression des Zytokins IL-17A darstellt. IL-27 scheint damit die Ausbildung einer schützenden Immunantwort gegen M. tuberculosis teilweise durch die Inhibition von IL-17A zu limitieren. Zugleich führt die Eindämmung der IL-17A-Expression durch IL-27 aber auch zu einer Verminderung immunpathologischer Konsequenzen. Zuletzt konnten wir in Mäusen mit einer Zelltyp-spezifischen Defizienz IL-27Rα-vermittelter Signalgebung in regulatorischen T-Zellen demonstrieren, dass die hemmende Wirkung von IL-27 auf die Ausbildung schützender Granulome teilweise auf eine direkte IL-27-vermittelte Induktion dieser immunsuppressiv wirkenden Zellen zurückzuführen ist (Abb. 1). Insgesamt bilden diese Arbeiten entscheidende Grundlagen zur weiterführenden Entwicklung adjuvanter Therapiestrategien mit dem Ziel die Architektur granulomatöser Lungenläsionen durch gezielte Immunmodulation zu optimieren.

Abb. 1. Die Zelltyp-spezifische Defizienz IL-27Rα-vermittelter Signalgebung in regulatorischen T-Zellen (T_reg) fördert die Bildung hochstrukturierter schützender Granulome. (A) Mäuse mit einer T_reg-spezifischen IL-27Rα-Defizienz (mittlere Spalte) bilden ähnlich wie Mäuse mit einer globalen IL-27Rα-Defizienz (rechte Spalte) nach der Infektion mit M. tuberculosis strukturierte Granulome in der Lunge, welche aus einem Lymphozytenring (obere Reihe) und einem zentralen Kern aktivierter Makrophagen (untere Reihe) zusammengesetzt sind. (B) In der chronischen Phase der M. tuberculosis-Infektion ist die bakterielle Last in T_reg-spezifischen IL-27Rα-defizienten Mäusen (mittelgraue Balken) im Vergleich mit der Kontrollgruppe (hellgraue Balken) reduziert.

Schädigende Granulome entstehen durch eine fehlgeleitete Immunantwort, bei der protektive Mechanismen der Erregerkontrolle in gewebszerstörende Prozesse umschlagen. Das zentrale histopathologische Merkmal der humanen TB, die zentrale Granulomnekrose nach Infektion mit M. tuberculosis, tritt dabei in Standard-Versuchsmäusen typischerweise nicht auf. Basierend auf unseren Untersuchungen in TB-Patienten beschrieb die Forschungsgruppe Infektionsimmunologie einen funktionellen SNP im IL4RA-Gen, der mit einer verstärkten Signaltransduktion und einer schwereren pulmonalen Pathologie assoziiert ist. Daraus ergab sich für uns die Hypothese, dass eine Th2-dominierte, über den IL-4Rα vermittelte Immunantwort maßgeblich zur TB-Pathologie beiträgt. Da konventionelle Mäuse nach Infektion mit M. tuberculosis keine entsprechende Th2-Immunantwort entwickeln, haben wir IL-13-überexprimierende Mäuse mit M. tuberculosis infiziert. In diesen Tieren führte die IL-13-getriebene Th2-Immunantwort über den IL-4Rα-Signalweg zur Ausbildung zentral nekrotisierender Granulome, welche das wesentliche histopathologische Merkmal der humanen postprimären TB sind. Damit verfügt die Forschungsgruppe Infektionsimmunologie über ein experimentelles Modell, das es ermöglicht, nachgeschaltete immunologische und metabolische Mechanismen der TB-assoziierten Gewebspathologie gezielt zu analysieren. In diesem Kontext kommt es zu einer ausgeprägten alternativen Aktivierung von Makrophagen mit starker Arginase-1-Expression, Lipidanreicherung und Bildung eines hypoxischen, von einer Kollagenkapsel umgebenen nekrotischen Granulomkerns. Diese Arginase-1-positiven Schaummakrophagen fördern sowohl den pathologischen Gewebeumbau als auch die bakterielle Persistenz innerhalb des Granuloms. Ergänzend konnten wir zeigen, dass schädigende Granulomnekrosen auch unabhängig von IL-13 induzierbar sind, wenn der NOS2-abhängige antimikrobielle Stoffwechselweg pharmakologisch durch den Inhibitor L-NIL blockiert wird. In Standard C57BL/6-Mäusen führt diese gezielte Hemmung zu einer Verschiebung des L-Arginin-Metabolismus hin zur Arginase-1-Aktivität und zur Ausbildung zentral nekrotischer Granulome mit fibrotischem Kollagenring. Entscheidend ist, dass diese Pathologie in Mäusen mit Makrophagen-spezifischem Knockout von Arginase-1 vollständig aufgehoben wird, obwohl die NOS2-Hemmung bestehen bleibt (Abb. 2). Damit belegen die Arbeiten der Forschungsgruppe Infektionsimmunologie, dass Arginase-1-abhängige Mechanismen ein zentraler, gemeinsamer Endpunkt schädigender Granulombildung sind und maßgeblich zur Pathologie, Therapieresistenz und Progression der TB beitragen.

Abb. 2. Die Abwesenheit von Arginase-1 führt zu einer verbesserten Abwehr von M. tuberculosis und einer modulierten Lungenpathologie. Durch die Gabe des NOS2 Inhibitors L-NIL wird in M. tuberculosis-infizierten Kontroll-Mäusen (Tie2cre^neg x Arg1^loxP/loxP) die Aktivität der Arginase-1 induziert. Diese Aktivität ist in Arg-1-defizienten Tieren (Tie2cre^pos x Arg1^loxP/loxP) aufgehoben. (A) Zu verschiedenen Zeitpunkten der Infektion wurden die Lungen der Tiere entnommen und die bakterielle Last (CFU) bestimmt. (B) Nach 101 Tagen wurden von den Lungen mikroskopische Schnitte angefertigt, welche mit Hematoxilin/Eosin (obere Reihe) oder immunhistologisch mit einem anti-Arg-1 Antikörper (untere Reihe) gefärbt wurden.

Nicht nur IL-13tg-Mäuse, auch C3HeJ/FeB-Mäuse entwickeln im Gegensatz zu Standard Inzuchtstämmen wie C57BL/6 die für die humane TB typische granulomatöse Pathologie mit zentraler Nekrose, Fibrose und hypoxischen Mikroumgebungen (Abb. 3).  Beide Modelle bieten damit die Möglichkeit, gemeinsame pathogenetische Merkmale dieser ausgeprägten Läsionen zu identifizieren und auf dieser Basis bislang unbekannte, nachgeschaltete Mechanismen der TB-Pathologie aufzudecken sowie die Wirksamkeit von Antibiotika unter pathophysiologisch relevanten Bedingungen präklinisch zu evaluieren.

Abb. 3. Im Gegensatz zu M. tuberculosis-infizierten BALB/c Mäusen bilden IL-13tg und C3HeB/FeJ Mäuse wie TB-Patienten zentral nekrotisierende Granulome aus. (A) BALB/c, (B) IL-13tg und (C) C3HeB/FeJ Mäuse wurden mit M. tuberculosis per Aerosol infiziert. Nach ca. 10 Wochen wurden die Lungen entnommen, mikroskopische Schnitte angefertigt und das Kollagen gefärbt (blaue Bereiche).  

Antibiotika-resistente M. tuberculosis Stämme stellen eine große Bedrohung für die globale Kontrolle der TB dar, weshalb neue Therapeutika dringend erforderlich sind. Die Medikamenten-Entwicklung gegen multiresistente TB (MDR-TB) benötigt eine präklinische Validierung in optimierten Tiermodellen, welche die pathophysiologischen Aspekte der humanen TB widerspiegeln, weil der komplexe Aufbau von zentral nekrotisierenden TB-Granulomen das Überleben von Mykobakterien begünstigt, jedoch die Wirksamkeit vieler Antibiotika verhindert. Daher hat die Forschungsgruppe Infektionsimmunologie in Kollaboration mit anderen Wissenschaftlern im Rahmen des Deutschen Zentrums für Infektionsforschung (DZIF) eine leistungsfähige präklinische Infrastruktur zur Evaluierung antimykobakterieller Wirkstoffe etabliert, welche auch in internationale Netzwerke (ERA4TB und UNITE4TB) eingebunden ist. Ein zentraler Baustein dieser präklinischen Plattform sind optimierte Mausmodelle (IL-13tg, C3HeB/FeJ), die eine humanähnliche Granulompathologie mit einem bakterienbeladenen, nekrotischen Kern und fibrotischer Kapsel ausbilden. Für eine umfassende in vivo Validierung neuartiger Therapeutika kombinieren wir diese optimierten Mausmodelle mit innovativen Methoden zur Wirkstoff-Detektion, wie Mass Spectrometry Imaging (MSI, Kollaboration mit Andreas Römpp, Universität Bayreuth) oder Laser Capture Microdissection (LCM) gekoppelte LC-MS/MS (Kollaboration mit Dominik Schwudke, Forschungszentrum Borstel). Außerdem ermöglicht die Kombination von LCM mit molekularen Methoden zur Detektion von M. tuberculosis (Molecular Bacterial Load Assay, MBLA) die Bestimmung der Erregerlast in nekrotischen Granulomen (Abb. 4). Im Rahmen dieser innovativen Infrastruktur haben wir das neuartige Antibiotikum BTZ-043 umfassend validiert. Dabei gelang der Nachweis, dass BTZ-043 zentral nekrotisierende Granulome vollständig penetriert, die Konzentration in diesen Läsionen deutlich über der in vitro minimalen Hemmkonzentration (1 ng/ml) liegt und dort antimykobakteriell wirksam ist (Abb. 5). Aufgrund dieser Eigenschaften hat BTZ-043 das Potential bereits eingesetzte TB-Antibiotika zu komplementieren und kann damit zu einer verkürzten Therapiedauer, Verhinderung von Reaktivierung und insbesondere zur Vermeidung von Antibiotika-Resistenzen beitragen. Die Wirksamkeit von Kombinationstherapien, die auf BTZ-043 basieren, wird derzeit in klinischen Studien (UNITE4TB und PanACEA) untersucht.

Abb.4. Präklinische Evaluierung von neuartigen Wirkstoffen im IL-13tg Maus-Modell mit humanähnlicher Pathologie. Die Infektion der Tiere mit M. tuberculosis, deren Behandlung mit Antibiotika und die Gewinnung von infiziertem Lungengewebe erfolgen in einer Laboranlage der biologischen Sicherheitsstufe 3. Nach Inaktivierung der Mykobakterien wird die Verteilung der Antibiotika im Lungengewebe mit Hilfe der Mass Spectrometry Imaging (MSI) Technik ermittelt. Die Konzentration der Medikamente in definierten pulmonalen Arealen wird durch die Kombination von Laser Capture Microdissection (LCM) und LC-MS/MS bestimmt. Die Überprüfung der antimykobakteriellen Aktivität in den Granulomen erfolgt mittels LCM und anschließender molekularer Detektion der Mykobakterien (Molecular Bacterial Load Assay, MBLA).

Abb.5. Validierung des neuartigen Antibiotikums BTZ-043 in IL-13tg Mäusen mit zentral nekrotisierenden Granulomen. (A) Räumliche und zeitliche Verteilung von BTZ-043. Die Korrelation der Histopathologie (HE Färbungen obere Reihe) mit der Verteilung von BTZ-043 in den Läsionen (MSI Messungen untere Reihe) zeigt eine erhöhte Intensität von BTZ-043 im Makrophagensaum der Granulome 2h nach Gabe und eine vollständige Penetration der nekrotischen Granulome zu späteren Zeitpunkten (4h und 8h). (B) Die Quantifizierung von BTZ-043 mittels Kombination von Laser Capture Microdissection (LCM, oben) und LC-MS/MS bestätigt die Anreicherung von BTZ-043 in nekrotischen Granulomen, wobei die Konzentrationen deutlich über der minimalen Hemmkonzentration liegen. (C) Nachweis der antimykobakteriellen Aktivität von BTZ-043 in zentral nekrotisierenden Granulomen durch die Kombination von LCM (oben) und molekularer M. tuberculosis Detektion (Molecular Bacterial Load Assay).

In einem umfassenden Forschungsprojekt untersucht die Forschungsgruppe Infektionsimmunologie, wie sich die Ausbildung nekrotischer Granulomläsionen durch gezielte Immunmodulation in IL-13tg- und C3HeB/FeJ-Mäusen therapeutisch beeinflussen lässt. Durch die Inhibition zentraler immunometabolischer und entzündlicher Signalwege – darunter Arg-1, p38MAPK, NLRP3, ACC2, IL-27Rα sowie Anaphylatoxin-Rezeptoren – wird das entzündliche und metabolische Milieu innerhalb der Granulome gezielt verändert, wodurch nekrotische Prozesse abgeschwächt und die Gewebearchitektur stabilisiert werden. Diese Modulation führt nicht nur zu einer verbesserten lokalen Immunbalance, sondern erleichtert auch die Penetration von Antibiotika in pathologisch veränderte Läsionen und erhöht damit deren Wirksamkeit unter krankheitsrelevanten Bedingungen. Während die Inhibition dieser Targets in C57BL/6-Mäusen bereits zu einer deutlichen Reduktion der pulmonalen Inflammation führt (Abb. 6), werden unsere IL-13tg- und C3HeB/FeJ-Modelle die Untersuchung dieser Ansätze in komplexen, humanähnlichen Granulomen ermöglichen. Das Projekt verbindet damit die mechanistische Aufklärung schädigender Immunantworten mit der Entwicklung adjuvanter, immunmodulatorischer Therapiestrategien zur Verbesserung bestehender Antibiotikaregime.

Abb. 6. Die p38MAPK Inhibition mit Doramapimod vermindert Gewebeentzündungen und reduziert die Keimlast in chronisch infizierten C57BL/6 Mäusen. C57BL/6 Mäuse wurden mit 100 CFU M. tuberculosis infiziert. Nach 28 Tagen wurden die Mäuse mit einem Vehikel, Doramapimod, Isoniazid (INH) und Rifampicin (RIF) oder INH/RIF und Doramapimod behandelt. Nach 56 Tagen wurde (A) die Anzahl der Granulome und (B) die Keimlast in der Lunge quantifiziert.